Стандартный протокол

1. Индуцируйте апоптоз в клетках, выбранным методом. Подготовьте отрицательный контроль, инкубируя клетки в отсутствие индуктора.

2. Подготовьте 1X buffer. Например, для 10 анализов добавьте 2,5 мл 5X buffer к 10 мл деионизированной воды.

3. Подготовьте рабочий раствор Propidium iodide (PI) с концентрацией 100 мкг/мл, разбавив 5 мкл стока PI (1мг/мл) в 45 мкл 1X buffer.

Неиспользованный остаток рабочего раствора можно хранить в темном месте при температуре 4°C для последующих экспериментов.

4. Соберите клетки после инкубации и промойте в холодном фосфатно-солевом буфере.

5. Осадите клетки центрифугированием, отбросьте супернатант и ресуспендируйте клетки в 1X buffer.

6. Посчитайте клетки и разведите в 1X buffer до ∼1 × 106 клеток/мл. Отберите 100 мкл в отдельную пробирку.

7. Добавьте 5 мкл AF488 Annexin V и 1 мкл рабочего раствора PI 100 мкг/мл (подготовленного на шаге 3) к 100 мкл клеточной суспензии (шаг 6).

8. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 минут.

9. После инкубации добавьте 400 мкл 1X buffer, аккуратно перемешайте и храните образцы на льду.

10. Как можно скорее проанализируйте окрашенные клетки методом проточной цитометрии, детектируя эмиссию в канале 530 нм, при длине волны возбуждения 488 нм (AF488 Annexin V) и в канале 610 нм, при длине волны возбуждения 561 нм (PI). Допускается использование близких каналов, рекомендуемых производителем оборудования.

11. При необходимости, подтвердите результаты проточной цитометрии, рассмотрев клетки под флуоресцентным микроскопом с использованием фильтров, соответствующих флуоресцеину (FITC) и тетраметилродамину (TRITC) или красителю Texas Red™.

Замечания

• Бактериальное или грибковое загрязнение образцов для скрининга или реагентов, а также перекрестное загрязнение между реагентами может привести к ошибочным результатам.
• Предпочтительны одноразовые наконечники для пипеток, колбы или стеклянная посуда, многоразовую стеклянную посуду необходимо вымыть и тщательно ополоснуть от всех моющих средств перед использованием.

Механизм работы

Аннексины представляют собой семейство кальцийзависимых  фосфолипидсвязывающих  белков, которые преимущественно связывают фосфатидилсерин (PS). При нормальных физиологических условиях PS преимущественно локализуется на  внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. После инициации апоптоза PS меняет локализацию и оказывается на поверхностии внеклеточной мембраны, помечая клетки как мишени для фагоцитоза. Оказавшись на внешней поверхности мембраны, PS может быть обнаружен флуоресцентно меченым Annexin V  кальцийзависимым образом.

Набор использует Annexin V, конъюгированный с красителем Alexa Fluor 488, для детекции фосфатидилсериновых участков на поверхности мембраны. В набор входит также Propidium iodide (PI), являющийся интеркалирующим красителем, проникающим только в клетки с поврежденной мембраной, и связывающимся  с клеточной ДНК в погибших клетках (рис 1). 

Рис. 1. Принцип действия набора “AF488 Annexin V / PI”.

На ранней стадии апоптоза плазматическая мембрана не будет пропускать внутрь клетки красители жизнеспособности, такие как Propidium iodide (PI). Эти клетки окрашиваются только AF488 Annexin V (AF488 Annexin V положительные, PI отрицательные). PI используется для детекции некротических клеток и клеток на поздней стадии апоптоза (AF488 Annexin V положительные, PI положительные).

Области применения

• Для маркировки опухолевых клеток для изучения ингибирующей активности DBP-maf (витамин D-связывающий белок-фактор активации макрофагов) на опухолевых клетках предстательной железы.

Zaidman B. Z. et al. Androgen receptor-dependent and-independent mechanisms mediate Ganoderma lucidum activities in LNCaP prostate cancer cells //International journal of oncology. – 2007. – Т. 31. – №. 4. – С. 959-967.

• Для неинвазивного выявления отторжения сердечного аллотрансплантата

Narula J. et al. Annexin-V imaging for noninvasive detection of cardiac allograft rejection. – 2001.

• Исследование гибели кардиомиоцитов, вызванной ишемией и реперфузией миокарда:

Dumont E. A. W. J. et al. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model //Circulation. – 2000. – Т. 102. – №. 13. – С. 1564-1568.

• Экспресс-анализ сперматозоидов для выявления изменений мембран после криохранилища

Glander H. J., J. Schaller. Binding of annexin V to plasma membranes of human spermatozoa: a rapid assay for detection of membrane changes after cryostorage //MHR: Basic science of reproductive medicine. – 1999. – Т. 5. – №. 2. – С. 109-115.

• Распознавание серповидноклеточной анемии

Kuypers F. A. et al. Detection of altered membrane phospholipid asymmetry in subpopulations of human red blood cells using fluorescently labeled annexin V. – 1996.

• При окрашивании клеток рака предстательной железы LNCaP для измерения активности экстрактов G. lucidum во время лечения рака предстательной железы.

Zaidman B. Z. et al. Androgen receptor-dependent and-independent mechanisms mediate Ganoderma lucidum activities in LNCaP prostate cancer cells //International journal of oncology. – 2007. – Т. 31. – №. 4. – С. 959-967.

• Для косвенного измерения активности флиппазы

Rizzo J. et al. Role of the Apt1 protein in polysaccharide secretion by Cryptococcus neoformans //Eukaryotic cell. – 2014. – Т. 13. – №. 6. – С. 715-726.

• Выявление апоптоза в клеточной линии немелкоклеточного рака легкого

Kumar R., Saneja A., Panda A. K. An annexin V-FITC—propidium iodide-based method for detecting apoptosis in a non-small cell lung cancer cell line //Lung Cancer: Methods and Protocols. – 2021. – С. 213-223.

• Роль PI3K/Akt и каспазных путей в апоптозе хондроцитов, вызванном окислительным стрессом

Li D. et al. PI3K/Akt and caspase pathways mediate oxidative stress-induced chondrocyte apoptosis //Cell Stress and Chaperones. – 2019. – Т. 24. – С. 195-202.